全農ET研ブログ

和牛の双子生産、第2回目の今回は、2卵移植の移植方法と受胎成績をご紹介します

○受精卵の準備

・1本のストローに1個の受精卵が入っているため、2本のストローを準備します。なお、2個の受精卵の血統は、全く同じものにする必要があります

○移植方法(片側子宮角vs両側子宮角)

・基本的な事ですが、受精卵は黄体が存在する側の子宮角へ移植します

・そのため、2卵移植の場合も黄体存在側の子宮角へ移植するのが良いと考えられます

・しかし、片側の子宮角へ受精卵を2個移植した場合、流産や難産の懸念がありました

・そこで本試験では、受精卵を片側の子宮角へ2個移植した場合(片側区)と、両側の子宮角へ2個移植した場合(両側区)とに分け、受胎率を比較しました

・なお、両側の子宮角へ2卵移植する場合は移植器を2本用意し、左右1回ずつ挿入する必要があります

・一方、片側の子宮角へ2卵移植する場合は(コツが必要ですが)1本の移植器に2個の受精卵をセットし、挿入を1回で済ませることができます

・供試牛は黒毛和種繁殖牛71頭(平均産次6.3)とし、延べ97回の移植を行いました

○結果

・受胎率は両区とも約60%と変わらなかったものの、双子率を比較すると、片側区の方が高くなりました(片側区42.6%vs両側区32.0%)

・この結果から、2卵移植は黄体が存在する片側の子宮角に実施した方が、双子率を高めることができます。やはり、両側区の場合、黄体が存在していない側に移植した受精卵が受胎しにくかったものと考えられます

・片側子宮角への2卵移植は双子受胎率以外にも、移植者とすれば挿入が1回で済むので作業的にも楽ですし、牛にとっても拘束時間が短くなりストレスが軽減できるといったメリットが考えられます

・なお、流産は両区ともほとんど無く、差は見られませんでした。一方で、ホルスタイン種では(自然発生した双子の例ですが)、片側子宮角に双子が発生した場合、両側子宮角の双子よりも流産率が高まるという報告もありますので、流産に関しては品種の違いがあるかもしれません

・なお、通常のエコーによる妊娠鑑定で、双子の確認も可能です。画面中央の胎子の左側に、2頭目の胎子がぼんやり見えています

次回は、双子受胎牛の妊娠末期の栄養管理に関する試験結果をご紹介します

昨夜ナイタイは初雪がふりました！
どんどん寒くなってきてます。

胚の性判別時にはバイオプシー（細胞片を回収）が必須なのですが、

大事な受精卵を切るなんて！
切った後も生きてるの・・・？

と思う方もいるのではないでしょうか。
バイオプシーした胚は移植されるまでインキュベーターにいれ、大事に保管しています。

写真はバイオプシー後4時間たったところ。

透明の細胞が栄養膜細胞で、切った直後は細胞が少なくなりさみしく感じます・・・
しかし、インキュベーター内で切った栄養膜細胞はどんどん育っていき、まるで切る前のように戻るのです。
これが移植しても大丈夫のサインでもあります。
毎回胚の生命力に感心し、受胎するんだぞ！と念をこめてストローにつめるのでした。

今回は繁殖とは関係ない記事ですが、、、

昨日発表されたノーベル医学生理学賞に、日本から大村智・北里大特別栄誉教授が選ばれました

大村教授は、アフリカなどの感染症に大きな治療効果を上げている薬剤「イベルメクチン」を開発。

この薬は、年間３億人に使われ、アフリカや南アジア、中南米で寄生虫による失明や深刻な病気の危機におびえる人々を救ったそうです。

寄生虫の教科書を見ても、大体の寄生虫はイベルメクチンで一発で駆除できるように記載されてます。
人の領域でも、犬猫の領域でも、牛の領域でも、イベルメクチンは切っても切り離せない関係です。
ET研究所でも、放牧から帰ってきた牛には、必ずイベルメクチンを牛の背中にかけてます。

大村教授は１９７４年、この薬の元になっている化学物質を作り出す微生物をゴルフ場の土壌の中から見つけ、「この微生物は他と違う」と直感したそうです。
この菌から寄生虫を麻痺させる作用を発見しました。

ペニシリンしかり、イベルメクチンしかり、人類の大きな発見は、意外と普通の日常の中に隠れているみたいですね。

それをいかに発展させるかは、個人の力量にかかっているみたいです。

私は、人類で初めて牛のお尻に手を入れた人を心から尊敬します

人の体外受精は、日本で年３０万回以上実施されており、成功するのは２割程度だそうです。
牛だと精液や卵子の品質にもよりますが、移植できるものは3割程度つくれるくらいでしょうか。
そこから妊娠！となるとさらに確率が下がってしまいます・・・

妊娠率をあげる注目すべき研究を紹介します。

山形大大学院理工学研究科、阿部宏之教授（生殖生物学）の研究が、独立行政法人科学技術振興機構の支援プログラムに採択されました。
「受精卵品質診断装置の開発」で、妊娠する可能性の高い受精卵を選ぶことにより、不妊治療の成功率を向上させることが期待されているそうです。

　阿部教授は、細胞内のミトコンドリアの呼吸（酸素消費量）で細胞の活性度が判定できることに注目。電気化学計測技術を応用した測定装置を開発した。山形牛の受精卵診断で使ってみたところ、妊娠率が２倍近くに伸びたという。ヒトの受精卵に応用すると、目視で形態評価した場合と比べて妊娠率は２倍、流産率は４分の１に下がった、としている。
　採択されたプログラムでは、超高感度マイクロ電極と医療対応の測定液を開発する。受精卵品質評価の精度を高めるだけでなく、再生医療での細胞診断にも応用できることを目指している。
　阿部教授によると、日本では夫婦７組に１組が不妊で、年間３万人が不妊治療を受けて出産している。人工授精や体外受精、顕微授精の成功率は１８％以下で、医療費負担の大きさ、母体への影響も無視できないという。
阿部教授は「晩婚化で不妊治療が増えている。新しい診断装置が出来れば体外受精の成功率を高めることができるようになる」と話しています。
　（朝日新聞　２０１５年２月２７日引用）

移植前に受精卵の見極めを良くすることで移植により母体にかかる負担が減るのではないでしょうか。今後の研究に期待です！

　牛の繁殖に携わっている方なら、プロスタグランジンF2α(PG)はご存知かと思います。

　PGといば黄体退行を引き起こし、発情を引き起こすことを主目的に用いられていますが、近年、PGの投与により排卵が引き起こされることを示す報告がなされており、ET研ニュースでも紹介されております(2012年11月号)。この報告は春季発動前の未経産牛へのPG投与により、初回排卵が早まったというものであり、さらなる臨床応用はできないか興味深いところですが、今年PGによる排卵誘起を定時人工授精 (FTAI) に組み込めないか検討した報告が出ましたのでご紹介したします

原著:The use of PGF2α as ovulatory stimulus for timed artificial insemination in cattle.

(和訳:牛の定時人工授精におけるPGF2αの排卵誘起剤としての使用)

出典:Theriogenology. 2014 Mar 15;81(5):689-95

著者:Pfeiferら

　この文献では、Day0安息香酸エストラジオール 1mg (EB)+ CIDR 9 Day + Day 9 PG 0.5 mg のプログラムにおいて、Day 10に排卵誘起剤としてEB 1mg を投与するか、PG 0.5 mgを投与するかによる比較を行っています。

 未経産牛の場合も経産牛の場合も、排卵率、受胎率ともに有意差はなく、エストロジェン製剤と同程度の成績を、PGでも見込めることが示唆されます(下表参照)。

有意差なし　

　PGの排卵誘起作用がFTAIでも有効であることが示されております。PGにより、下垂体に対するGnRHの作用が強まり、LHの放出が増強されるとともに、排卵前の卵胞にも直接作用している可能性があるとも考えられているようです。

　FTAIのコスト削減や、他剤との併用による効率向上など、さらなる応用が期待されますね

　さて、本日は4週にわたりお送りしてきた「eCG(ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン)」の使途についての紹介の最終回です

　本日は、より臨床での応用が期待できる、「eCGの定時人工授精プロトコルへの適応」についての適応についてご紹介していきます

原著：Use of Equine Chorionic Gonadotropin to Control Reproduction of the Dairy Cow: A Review

著者：F De Rensis and　F López-Gatius

出典　Reproduction in Domestic Animals Vol 49, 2,  177-182

・GnRH、PGF2α、E2等のホルモン剤を使用して、定時人工授精(FTAI)が行われているが、栄養状態が制限された状況や、分娩後早期、低BCS、暑熱ストレス、無発情牛においては、FTAIの成績は安定しないことが多い。

・一方、eCGのLHおよびFSH双方の作用により、上記のネガティブファクターがある中で、FTAI成績が向上した報告がある。

・Souza et al. (2009)･･･低BCS牛で大幅に受胎率向上

・Gracia-Ispierto et al. (2013)・・・無発情牛を対象に試験

＊: 有意差あり

・一方、BCSが低い牛の割合が少ない牛群では、eCGを用いたプロトコルにより成績が向上しなかったという報告もある (Ferreira et al. 2013)

・eCG投与でにより双胎が増え、プロジェステロン除法剤の留置により増える傾向があるが、5日間留置の場合は9日留置の場合よりも双胎を減らすことができる。

→結論として、eCG投与を組み込んだプロトコルは無発情や低栄養状態において良好な成績を発揮しうる。

・・・以上、暫くの間お付き合いいただきましたが、お役に立てそうな情報はありましたでしょうか？

なかなか牛の状態が良くならず、繁殖でもお困りな状況にある方は、活用されるのも一つの手かと思います

「eCG(ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン)」の使途についての紹介の③回目です

本日は「eCG処置の卵胞と黄体における性ステロイドホルモン合成に及ぼす影響」について紹介いたします

原著：Use of Equine Chorionic Gonadotropin to Control Reproduction of the Dairy Cow: A Review

著者：F De Rensis and　F López-Gatius

出典　Reproduction in Domestic Animals Vol 49, 2,  177-182

・eCGは顆粒層細胞と卵胞膜細胞におけるエストロジェン (E2) およびプロジェステロン(P4) 分泌を促進する。

 ・卵胞期では、E2産生促進による正のフィードバックにより、排卵前のLHサージに作用する。

 ・分娩後14日目の乳牛においても、eCG　750 IU投与により、無投与よりE2産生が促進される。

 ・発情から7日目の黄体期に投与すると、黄体の成長が促進され、血中P4濃度の上昇が、無投与の場合より2日程度早まる。一方、黄体の大きさ自体には影響しないことから、機能性の黄体細胞の比率および機能の増加が生じるのだと考えられる。

・排卵前のeCG投与もP4濃度を増加させる。これは、eCGが顆粒層細胞・卵胞膜細胞の双方に働き、卵胞を増大させ、黄体も増大させることによると考えられる。

 →結論として、eCG投与は黄体に直接働きP4産生を促進するのみならず、排卵前の卵胞に働き、卵胞機能およびサイズを増大させることで、黄体発育を促進し、P4産生を促進する。

　・・・排卵前および、黄体形成後もP4分泌を向上させる、とういことは即ちAIでもETでも応用できる可能性があるなぁと感じました

　次回はいよいよ最終回！！「eCGの定時人工授精プロトコルへの適応」についてです

　eCGといえば、馬の子宮内膜胚（胎盤の一部）から生産され、馬でLH作用、他の動物ではFSH作用を強く示すホルモンとして、多くの方がご存知かと思います。

　過去には過剰排卵処理によく用いられていましたが、半減期が長いため、発情後も卵胞が発育し続け、受精および胚の発育・輸送を妨げてしまうため、現在はあまり使用されていません。

　学生時代に得たこういった知見から、個人的にはeCGにあまりよいイメージは無かったのですが、発情同期化関連の文献を見ていると、案外目にする機会が多いと感じています

　これから木曜日に数回に渡り、先日出された総説を基に、eCGの使い道についてご紹介していきたいと思います

原著：Use of Equine Chorionic Gonadotropin to Control Reproduction of the Dairy Cow: A Review

著者：F De Rensis and　F López-Gatius

出典　Reproduction in Domestic Animals Vol 49, 2,  177-182

序論：

eCGの歴史

　eCGは妊馬血清性腺刺激ホルモン（PMSG）とも呼ばれ。1936年に発見された。1938年に、eCG使用の国際基準が確立され、1941年には、eCGにより卵胞発育を促し、hCGにより排卵を誘起する「2段階プロトコール」がヒトで用いられた。このプロトコールは長期にわたり使用されてきたが、eCG投与により抗体が産生されることが問題視され、1972年にヒトでは用いられなくなった。対照的に、1934年に750IU投与が発情と排卵を引き起こすことが報告されて以来、牛では使用され続けている。

eCGの分子特性 

　eCGはLHやFSHと同じ糖タンパクホルモンのファミリーである。LHやFSHが全ての哺乳類の下垂体から分泌される一報、eCGは妊娠中の馬の子宮内膜胚（胎盤の一部）で生産される。eCGは二つのタンパク質の構成要素からなり、その一方のタンパク質の構造はLHと同一であるが、そのタンパク質に結合している糖鎖の違いにより、eCGのほうが肝臓での代謝や腎臓での濾過を受けにくいため、LHよりも半減期が長い。牛に1500IU投与すると、血中での生理活性は5日程度持続する。

 　また、eCGは卵巣上のLHとFSH双方の受容体に対する親和性が高いため、双方の反応を引き起こす。よって牛では、繁殖をコントロールする動物用医薬品として用いられる。

　一般的には、単一の排卵を促進するためには200～1000IU、過剰排卵を引き起こすためには2500IUが必要であると考えらている。

　　・・・今回はeCGの基礎的な内容について書かせていただきました。次回はeCG投与の卵巣上の卵胞への反応についてご紹介します。

新たな精子の精製方法により受胎率が良くなったという論文を紹介いたします。

原題：Increased Conception Rates in Beef Cattle Inseminated with Nanopurified Bull Semen.（ナノ粒子精製精液により肉牛の受胎率が向上した）　Biol Reprod. 2014 Sep 17

ユビキチンとよばれる欠損した精子の細胞表面に付着するたんぱくと
Peanut agglutinin(PNA)と呼ばれる欠損したアクロソーム（精子頭部にある受精にかかわる部位）に独占的に付着するたんぱくの
それぞれに対する抗体をコートしたナノ粒子を精液と混ぜます。
磁石を用いて抗体に結合した精子を集めることで不良な精子を～30％取り除き、
ストローあたり1000万精子（10M）または2000万精子（20M）を封入し凍結します。
実験区は未処置の精液（10Ｍ　ＣＯＮ）と（20Ｍ　ＣＯＮ）、ＰＮＡ（10Ｍ　ＰＮＡ）、ユビキチン（10Ｍ　ＵＢＩ）の４区です。

肉用牛にＡＩした受胎率の結果は下のようになりました。
（10Ｍ　ＣＯＮ）53.7％
（20Ｍ　ＣＯＮ）63.3％
（10Ｍ　ＰＮＡ）64.5％
（10Ｍ　ＵＢＩ）51.3％

未処置1000万精子とPNA2000万精子をもちいた受胎率に有意差はみられませんでした。
また、PNA区では精子を精製する際の回収率が68．5％でした。

このことからPNAナノ粒子精製をすれば未処置精子の半分で同じ受胎率が得られます。
さらに、作製できるストロー数も未処置精液より多くなることがわかりました。

あたらしい発想でおもしろいなと感じました！
現場で実用化されるようになるのでしょうか？

9月ですね。

今年は冷夏という記事もありましたが、十勝はさらに最近めっきり涼しくなってきました。

ヒートストレスは繁殖に悪影響を及ぼすのは皆さんご存知かと思います。

季節的に過ごしやすい秋口は牛の繁殖にうってつけのようにも思えますが、ヒートストレスからの回復はそう簡単ではないことを明らかにした論文をご紹介します（ちょっと古いのですが）

タイトル：Improvement of quality of oocytes collected in the autumn by enhanced removal of impaired follicles from previously heat-stressed cows

(和訳:ヒートストレス感作により傷害を受けた卵胞の積極的な吸引による秋季回収卵母細胞の品質の改善)

出典:Reproduction (2001) 122, 737–744

著者：Rothら（ヘブライ大学）

緒言:

　乳牛の繁殖能力は夏季に低下するが、ヒートストレスが消失した秋季であっても低い状態が続く。

　本研究は夏季のヒートストレスが遅延して秋季の卵母細胞の品質に及ぼす影響を明らかにするとともに、夏季にヒートストレスを受けた卵胞を積極的に除去することで卵母細胞の品質を改善させることを目的に行った。

材料及び方法：

供試動物:夏季にヒートストレスを受けたホルスタイン種経産牛　16頭

実験方法：秋季に4つの連続した発情周期において、試験区、対照区下記の日程で3-7 mmの卵胞を超音波ガイド下でOPUにより吸引した。発情19日目でPGF2αを投与し、発情21日目でGnRHを投与し、繁殖周期を維持させた。各周期のDay4で回収した卵母細胞を体外受精に供した。

表:　対照区と試験区における4つの連続した発情周期において卵胞を吸引した日程

結果：

・高品質胚(グレード1)の割合の増加が試験区(周期2)の方が対照区(周期3)より早かった。

・卵割率は対照区で38-58%であったが、試験区では40-75%であり、周期3,4で有意に高かった (P < 0.05)

・胚盤胞発生率は、試験区では低いままであったが、対照区では周期3、4で有意に増加した(P < 0.05)

・・・というわけでヒートストレスの影響は涼しい秋になってもしぶとく残り続けるようです一方傷ついた卵胞を膿を取り除くように頻繁に吸引することで、卵母細胞の発生能は高まるようですね！

受精卵回収においてもプログラムに入る前段階での卵胞吸引が有効な気がします